Noul coronavirus SARS-CoV-2 a aparut in Wuhan, China la inceputul lunii decembrie a anului trecut provocand un numar mare de imbolnaviri in toata lumea. Extinderea rapida a determinat oamenii de stiinta si lumea medicala sa ia masuri pentru a lupta cu aceasta amenintare a sanatatii publice la nivel mondial. S-a aflat structura virusului si s-au dezvoltat metode de depistare a infectiei, dar sunt multe intrebari la care se cauta inca raspunsuri.
Metoda de diagnosticare a infectiei COVID-19 utilizata in prezent este reprezentata de testarea RT-PCR, un test care pune in evidenta prezenta virusului in secretiile infectate recoltate de la pacienti. Este o metoda buna de diagnosticare, dar care poate fi realizata doar in laboratoare echipate modern, cu personal bine antrenat, inalt calificat, care au kituri de testare disponibile.
In toata lumea se cauta solutii pentru a se pune in evidenta infectia utilizandu-se metode mai simple, mai usor de utilizat, dar care sa dea rezultate bune si cu o viteza mai mare. O solutie ar putea sa vina din zona evidentierii raspunsului imun al organismului la infectia COVID-19. Daca testele rapide par sa nu fie suficient de robuste pentru a se utiliza in diagnosticare, un raspuns ar putea veni din partea testelor serologice care utilizeaza tehnici robuste de laborator (tehnica ELISA, chemoluminiscenta, etc) teste care se pot dovedi utile in a indica persoanele care au trecut prin infectie deja.
De ce sunt necesare teste de laborator pentru stabilirea diagnosticului infectiei COVID-19
Infectia COVID-19 se prezinta cu o mare variabilitate a semnelor si simptomelor. Pot fi persoane asimptomatice, dar care sa aiba infectia, altele vor avea febra si vor tusi, o parte pot sa dezvolte pneumonie sau chiar insuficienta respiratorie, altele pot sa aiba manifestari digestive. Pentru ca lucrurile sa fie si mai complicate, simptomele cel mai frecvent intalnite sunt foarte asemanatoare cu simptomele altor afectiuni respiratorii precum raceala comuna (viroze respiratorii obisnuite), gripa sau alergiile. Acest lucru face ca infectia COVID-19 sa nu se poata diagnostica doar pe baza simptomelor. Pentru a putea spune cu certitudine ca este infectie data de coronavirusul SARS-CoV-2 este nevoie de utilizarea unor teste de laborator specifice.
Chiar daca este vorba de un virus necunoscut, datorita secventierii genetice rapide si publicarii rezultatelor cercetarii, a fost posibila cunoasterea genomului viral la inceputul lunii ianuarie a acestui an. Pe aceasta baza au fost dezvoltate teste de depistare a infectiei si protocoale pentru a se utiliza testele respective in cadrul laboratoarelor de biologie moleculara. Este vorba de teste de tip RT-PCR care identifica prezenta virusului in secretiile nasofaringiene si oro-faringiene ale persoanei infectate. Secretiile nasofaringiene se recolteaza cu ajutorul unui betisor cu tampon de vata steril din nasul si gatul pacientului, sunt trimise la laborator si acolo sunt analizate.
Aceste teste au avantajul ca pun in evidenta virusul, chiar daca titrul viral e scazut (in cantitati foarte mici), astfel incat persoanele infectate vor fi detectate in marea lor majoritate, inca din primele zile de infectie. Este nevoie ca probele recoltate sa contina ARN viral intact, care sa poata fi recunoscut si amplificat, altfel pot sa apara probe cu rezultat negativ, desi persoana este infectata.
Testele RT-PCR se realizeaza in laboratoare specializate de biologie moleculara in care se iau masuri de siguranta sporite, care au echipamente speciale si in care lucreaza personal inalt calificat. Dat fiind viteza cu care se raspandeste virusul, este foarte probabil ca posibilitatea de reactie a acestor laboratoare sa fie depasita, de aceea se cauta solutii pentru dezvoltarea de teste care sa fie mai simplu de utilizat, care sa poata fi utilizate si in laboratoare mai putin specializate, care sa fie mai aproape de locul in care este ingrijit pacientul (denumite teste de tip “point-of-care”).
Astfel ca atentia s-a indreptat catre posibilitatea de a utiliza teste imunologice pentru detectarea COVID-19. Din categoria testelor imunologice fac parte testele rapide bazate pe detectia de anticorpi, testele rapide bazate pe detectia de antigen si tehnicile robuste, aplicabile in laboratoarele clinice, pe care le numim teste serologice.
Pot testele rapide pe baza de anticorpi anti- coronavirus SARS-CoV-2 sa puna diagnosticul de COVID-19?
Testele rapide bazate pe detectia de anticorpi nu pot fi utilizate pentru stabilirea diagnosticului de infectie COVID-19.
Testele rapide sunt teste de tip calitativ (rezultatele date sunt de tip pozitiv - probabil infectia este prezenta, sau negativ - probabil infectia nu este prezenta), asemanatoare testelor de sarcina, care pot sa puna in evidenta anticorpii anti SARS-CoV-2 daca acestia sunt prezenti, in probe de sange recoltate de la pacient (picaturi de sange din deget).
Mai multe firme si-au indreptat atentia catre dezvoltarea de teste care sa puna rapid in evidenta prezenta anticorpilor specifici pentru coronavirusul SARS-CoV-2. Totusi rezultatele obtinute pana in prezent nu sunt satisfacatoare.
De ce? In primul rand, nu pot detecta infectia in primele zile. Pentru ca se bazeaza pe detectia de anticorpi, care apar in principal dupa 1- 2 saptamani de cand o persoana se infecteaza (la unele persoane putand sa dureze chiar mai mult), testele nu pot stabili daca o persoana este infectata, in primele zile ale infectiei. Aplicarea testului la o persoana infectata, care nu a dezvoltat inca anticorpi, va da un rezultat incorect, negativ (fals negativ) – indicand ca persoana nu este infectata, desi este.
O alta problema este data de rezultatele pozitive incorecte pe care le poate da testul rapid. Daca o persoana are o infectie cu un alt virus din familia mare a coronavirusurilor, este posibil ca testul sa indice (incorect) ca persoana este infectata (rezultat fals pozitiv).
Capacitatea testelor de a identifica in mod corect persoanele care au avut boala si persoanele care nu au fost expuse infectiei ramane scazuta. Multe dintre testele existente pe piata au fost autorizate numai dupa ce si-au dovedit performanta intr-un laborator, fara a trece testul vietii reale, dovedindu-se ca avand validiate scazuta.
Dna dr. Andreea Cristina Alexandru medic primar medicină de laborator, medic-șef Laborator Central București și director medical Divizia Laboratoare Clinice REGINA MARIA explica “Testele rapide si cele de tip point-of -care au avut o dezvoltare importanta in ultimii ani devenind din ce in ce mai complexe si sofisticate, permitand executia cu volume de probe mici. Cu toate acestea, raman in continuare probleme cu sensibilitatea si specificitatea acestor tipuri de teste. In infectia COVID-19 au fost inregistrate cazuri cu raspuns imun - prin producerea de anticorpi- scazut, tardiv sau chiar absent; iar frecventele rezultate fals pozitive pot sa fie generate de infectii cu alte tipuri de coronavirusuri; de aceea, Organizatia Mondiala a Sanatatii nu recomanda utilizarea testelor rapide bazate pe detectia de anticorpi pentru pacienti.”
Astfel ca, datorita nesigurantei rezultatelor testarilor rapide, atentia lumii medicale se intreapta catre alte tipuri de testari care sa ajute la stabilirea mai acurata a numarului cazurilor de COVID-19, a celor care au trecut prin infectie (cu sau fara simptome) bazandu-se pe raspunsul imun determinat de expunere.
Testele serologice: utile pentru detectarea persoanelor care au fost infectate COVID-19
Exista posibilitatea ca o parte dintre persoanele care sunt infectate sa nu prezinte semne si simptome, ceea ce face imposibil de stiut cate persoane au fost de fapt infectate cu noul coronavirus atata timp cat testarile de tip RT-PCR se fac la persoane simptomatice. Este important sa se cunoasca daca o persoana care nu a avut semne de boala, a fost anterior infectata. Se poate urmari astfel raspandirea bolii, dar se poate afla si daca persoana si-a dezvoltat un raspuns imun si este este protejata de infectie.
Nu se cunoaste cu certitudine daca o persoana infectata care s-a vindecat ar putea sa se imbolnaveasca din nou, dar exista opinii bazate fie pe studii pe animale de laborator, fie pe studii anterioare cu alte tipuri de coronavirusuri (MERS si SARS), conform carora trecerea prin infectie va produce un raspuns imun care protejeaza de reinfectie. Nu se cunoaste nici pentru cat timp ar fi protejata persoana care s-a vindecat.
Testele serologice - care detecteaza raspunsul imun al organismului uman la infectia cu noul coronavirus SARS-CoV-2 - pot confirma sau infirma prezenta anterioara a infectiei. Imunoglobulina M (IgM) este tipul de anticorp produs de sistemul imun imediat dupa infectie, altfel spus, este prezenta in prima linie de aparare in timpul infectiilor virale, inainte ca sistemul imun sa produca anticorpii de tip IgG. Imunoglobulinele G sunt anticorpi extrem de specifici care sunt importanti pentru imunitatea pe termen lung si memoria imunologica.
Utilizarea testelor care sa identifice persoanele expuse anterior virusului pe baza existentei raspunsului imun (IgM si IgG) - mai ales a celor care au fost infectate, dar nu au avut simptome - ar putea sa sprijine raspunsul de control al infectiei, prin screeningul grupurilor expuse – medici, asistente medicale, lucratori din industria alimentara care deja au imunitate impotriva infectiei si s-ar putea intoarce sau ar putea sa continue sa lucreze.
Dna Dr. Andreea – Cristina Alexandru spune ca “testele serologice sunt tehnici imunologice robuste, aplicabile in laboratoarele clinice, care masoara anticorpii sau proteinele prezente in organism in momentul in care organismul se intalneste cu o infectie anume, de exemplu COVID-19. Acestea detecteaza raspunsul imun al organismului cauzat de infectia cu virusul si nu detecteaza virusul in sine.”
Utilizarea testelor serologice este limitata de faptul ca in primele zile ale infectiei organismul de-abia incepe sa produca anticorpii, acestia nefiind detectabili. Totusi, utilizarea testelor serologice complementar testarii RT-PCR se poate dovedi de ajutor in lupta cu infectia COVID-19. Testele RT-PCR sunt utile pentru a identifica prezenta virusului in timpul infectiei, dar nu pot stabili daca persoana a fost infectata si s-a recuperat. Testele serologice sunt utile deoarece confirma persoanele care au fost expuse si au dezvoltat un raspuns imun protector.
Dna Dr. Andreea – Cristina Alexandru considera ca “testarile serologice pot juca un rol important in lupta cu infectia virala, putand identifica persoanele care au avut infectia cauzata de virusul SARS-CoV-2 si au dezvoltat un raspuns imun adecvat. Aceste rezultate vor putea fi folosite impreuna cu alte date clinice, la identificarea persoanelor care nu mai sunt succeptibile pentru a dezvolta infectia si care se pot intoarce la munca, la identificarea persoanelor care vor putea sa isi doneze plasma din perioada convalescentei pentru a putea sa fie utilizata ca tratament alternativ pentru cazurile severe de COVID-19.”
In cazul infectiei COVID-19 este util ca testarea serologica sa se faca in perechi, adica sa se efectueze testarea in momentul debutului bolii, in faza acuta si in convalescenta, in perioada de recuperare dupa boala, pentru a urmari seroconversia si a identifica persoanele care au trecut prin boala si au dezvoltat anticorpi. Desi testele serologice nu pot diagnostica rapid infectia acuta – in aceasta faza ramanand valabila indicatia de testare moleculara RT-PCR COVID-19 – aceste teste monitorizeaza raspunsul imun pe care il dezvolta organismul, pe termen scurt si lung.
Cum se efectueaza testarea serologica folosind tehnica ELISA pentru COVID-19
Testele serologice utilizeaza probe de sange, plasma sau ser recoltate de la pacient pentru a pune in evidenta complexele anticorp-antigen care se formeaza daca in probele recoltate de la pacient exista anticorpi specifici. Probele recoltate de la pacient se pun in contact cu antigenele virale de laborator si se incubeaza. Daca in probele recoltate exista anticorpi specifici pentru antigenele virale, anticorpii se vor lega de antigenele virale. Formarea complexelor anticorp-antigen poate sa fie evidentiata cu ajutorul unor enzime anti -imunoglobuline. Intensitatea reactiei dintre complexul anticorp- antigen si enzima anti-globulina este masurata prin spectrofotometrie.
Tehnica ELISA (metoda imunoenzimatica) este o tehnica imunologica frecvent utilizata in toate laboratoarele clinice pentru determinarea anticorpilor, enzimelor, hormonilor.
“Determinarea anticorpilor prin tehnica ELISA are la baza o reactie antigen – anticorp specifica, determinand prezenta in sange a anticorpilor de tip IgG sau IgM dezvoltati de organism impotriva COVID-19. Pe baza masurarii densitatii optice in urma reactiei enzimatice specifice se interpreteaza rezultatul ca Negativ/ Pozitiv/ Echivoc. Rezultate Echivoce pot aparea in cazul rectiilor nespecifice antigen-anticorp frecvent intalnite in cazul infectiilor cu virusuri din genul Coronavirusuri altele decat COVID-19” explica dna dr. Andreea – Cristina Alexandru.
Testele RT-PCR detecteaza prezenta infectiei, infectie activa la momentul efectuarii testului. Sunt utile pentru a diagnostica boala. Testele serologice detecteaza daca ai avut infectia. Sunt utile pentru a evidentia cine si cate persoane au trecut prin infectie.
Pandemia a determinat laboratoarele de biologie moleculara sa se numere printre serviciile medicale cele mai solicitate in aceasta perioada, trebuind sa raspunda de urgenta solicitarilor de diagnosticare a infectiei si in acelasi timp, sa ia toate masurile necesare pentru a maximiza siguranta personalului care lucreaza aici si pentru a preveni orice risc ne-necesar. Laboratoarele Regina Maria prelucreaza teste RT-PCR pentru diagnosticarea infectiei COVID-19 si teste serologice pentru monitorizarea raspunsului imun la infectia COVID-19 la solicitarea autoritatilor.
Surse:
1. IgM in microbial infections: taken for granted? Racine, Rachael, and Gary M Winslow. Immunology letters vol. 125,2 (2009): 79-85. doi:10.1016/j.imlet.2009.06.003
2. Production of specific antibodies against SARS‐coronavirus nucleocapsid protein without cross reactivity with human coronaviruses 229E and OC43. Lee HK, Lee BH, Seok SH, et al. J Vet Sci. 2010;11(2):165‐167.
3. Profiling Early Humoral Response to Diagnose Novel Coronavirus Disease (COVID-19), Clinical Infectious Diseases, Li Guo, et all, https://doi.org/10.1093/cid/ciaa310
4. Antibody Responses to SARS-CoV-2 in Patients of Novel Coronavirus Disease 2019. Juanjuan Zhao et al. Clin Infect Dis. Mar 28, 2020, doi: 10.1093/cid/ciaa344.
5. COVID-19: immunopathology and its implications for therapy. Cao, X. Nat Rev Immunol (2020). https://doi.org/10.1038/s41577-020-0308-3
6. Joint European Roadmap towards lifting COVID-19 containment measure, https://ec.europa.eu
7. Development and clinical application of a rapid IgM‐IgG combined antibody test for SARS‐CoV‐2 infection diagnosis. Zhengtu Li, Yongxiang Yi, Xiaomei Luo et all, 27 February 2020, Journal of Medical Virology, https://doi.org/10.1002/jmv.25727
8. Universal Screening for SARS-CoV-2 in Women Admitted for Delivery, Desmond Sutton, Karin Fuchs, Mary D’Alton, Dena Goffman. Correspondence, April 13, 2020, The New England Journal of Medicine, DOI: 10.1056/NEJMc2009316
9. https://thenativeantigencompany.com
10. https://rega.kuleuven.be